Zawierająca domenę 7 typu thrombospondyna w idiopatycznej nefropatii błoniastej AD 2

Immunoprecypitaty zebrano, poddano elektroforezie, przeniesiono na błonę i zbadano pod kątem obecności białka THSD7A przy użyciu przeciwciał anty-THSD7A (Przeciwciała Atlas), jak opisano powyżej. Spekrtometria masy
Regiony żelowe odpowiadające widocznym prążkom w blotach Western wycięto i poddano trawieniu trypsyną w żelu. Strawione peptydy zidentyfikowano za pomocą spektrometrii masowej, jak opisano w dodatkowym dodatku.
Analiza histologiczna i elucja autoprzeciwciał
Immunofluorescencję i analizy immunohistochemiczne ekspresji THSD7A w zdrowych i chorych nerkach i eksperymentach z wymywaniem autoprzeciwciał przeprowadzono zgodnie z opisem w Dodatkowym Dodatku.
Wyniki
Badanie przesiewowe próbek surowicy za pomocą ludzkiego ekstraktu z kłębuszkowego białka
Ryc. 1. Ryc. 1. Wykrywanie autoprzeciwciał przeciwko nieznanemu antygenowi u pacjentów z nefropatią błoniastą. Panel A pokazuje reaktywność próbek surowicy z ludzkimi ekstraktami kłębuszkowymi (HGE). Cztery z początkowo przebadanych próbek od pacjentów z błoniastą nefropatią (MN) reagowały z białkiem kłębuszkowym o wielkości około 250 kD (MN do MN 4), ale nie z rekombinowanym receptorem fosfolipazy A2 (rPLA2R1). Panele B i C wykazują ogólną reaktywność odpowiednio w kohorty europejskiej i Boston. FSGS oznacza ogniskową segmentową stwardnienie kłębuszków nerkowych i chorobę minimalnej zmiany MCD. Liczba powyżej każdej kolumny wskazuje frakcję próbek pozytywnych dla białka o masie 250 kD.
Przebadaliśmy próbki surowicy od pacjentów z błoniastą nefropatią i odpowiednie kontrole przeciwko białkom całkowitym w ludzkich ekstraktach kłębuszkowych. Reaktywność surowicy badano początkowo metodą Western blot w warunkach nieredukujących w surowicy od 65 pacjentów z błoniastą nefropatią (z czego 30 było ujemnych w odniesieniu do przeciwciał anty-PLA2R1), 76 pacjentów z innymi białkowymi lub autoimmunologicznymi chorobami nerek i 44 zdrowymi osobami kontrolnymi. Wszystkie próbki, o których wiadomo, że są pozytywne wobec przeciwciał anty-PLA2R1, jak testowano wcześniej za pomocą ELISA, reagowały z natywnym i rekombinowanym PLA2R1 za pomocą Western blot (MN 45 na Figurze 1A). Próbki od 4 pacjentów z idiopatyczną błoniastą nefropatią, z których wszystkie były seronegatywne dla przeciwciał anty-PLA2R1, rozpoznawały białko kłębuszkowe o wielkości około 250 kD (MN1 do MN4 na Figurze 1A). Próbki od pacjentów z innymi chorobami kłębuszkowymi lub zdrowymi kontrolami nie wykazywały podobnej reaktywności (Figura 1A i Fig. Badanie przesiewowe rozszerzono na 152 pacjentów z nefropatią błoniastą (118 z idiopatyczną i 34 z wtórną nefropatią błoniastą) (tabela S1 w dodatkowym dodatku). Łącznie 7 próbek surowicy, z których wszystkie były ujemne dla przeciwciał anty-PLA2R1, wykazało reaktywność w tym samym regionie 250 kD (Figura 1B).
W niezależnej kohorcie Uniwersytetu w Bostonie obejmującej 365 pacjentów z idiopatyczną błoniastą nefropatią i 33 z wtórną błoniastą nefropatią (tabela S2 w dodatkowym dodatku), 10 dodatkowych pacjentów, którzy byli seronegatywni w kierunku przeciwciał anty-PLA2R1, jak określono za pomocą analizy Western blot i ELISA, zostali zidentyfikowani; Próbki surowicy od tych 10 pacjentów wykazywały podobną reaktywność do białka 250 kD obecnego w kłębuszkach ludzkich (Figura 1C i Tabela
Badanie przesiewowe pozwoliło zidentyfikować przypuszczalny autoantygen o wielkości 250 kD, występujący w normalnych ludzkich kłębuszkach. Stwierdzono, że białko to było N-glikozylowane w mniejszym stopniu niż PLA2R1 i ulegało ekspresji niemal wyłącznie w błonach komórkowych, co sugeruje, że był to nieznany dotychczas antygen, który różni się od PLA2R1 (Fig. S2 w dodatkowym dodatku). Przebadaliśmy także surowicę od pacjentów z idiopatyczną błoniastą nefropatią przeciwko trzem paralogom PLA2R1 (MRC1, MRC2 i LY75), 8 ale nie zaobserwowaliśmy żadnej reaktywności (rys. S3 i
Identyfikacja antygenu jako domeny 7 zawierającej trombosponinę typu
Zastosowaliśmy dwie niezależne strategie identyfikacji antygenu. W pierwszym przeprowadziliśmy elektroforezę żelową i analizę Western blot białek kłębuszkowych, nieleczonych lub traktowanych samą N-glikopeptydazą F lub z N-glikopeptydazą F i neuraminidazą; analizy te wykazały trzy różne pasma – 250 kD, 225 kD i 200 kD (ryc. S2B w dodatku uzupełniającym). W drugiej strategii, białka kłębkowe były częściowo proteolizowane za pomocą trypsyny, z lub bez wcześniejszego leczenia N-glikopeptydazą F. Wszystkie obszary żelu odpowiadające sygnałom typu Western blot wycinano i analizowano za pomocą spektrometrii mas i generowano listę potencjalnych antygenów białkowych. (Tabela S4 w Dodatku uzupełniającym)
[więcej w: emg legnica, kto nie może zostać dawcą szpiku, zdrowa żywność bezglutenowa ]

Powiązane tematy z artykułem: emg legnica kto nie może zostać dawcą szpiku zdrowa żywność bezglutenowa